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川山茶ISSR-PCR及SSR-PCR优化体系建立及比较

作者: 刘家艳,权俊萍 时间:2020-7-3 阅读次数:488

山茶是山茶科Theaceae山茶属Camellia中以观赏为主要栽培目的种、变种、品种等种质的统称,它栽培历史悠久,具有很大观赏价值,是我国十大传统名花珍贵花木,也是世界名贵花卉之一。我国是世界山茶属植物原产地和起源中心,是山茶属植物资源最丰富的国家,中国植物志记载约239种,其中90%以上分布于我国南部和西南部[1]。山茶在巴蜀地区栽培已有2000多年的历史,重庆地区凡园、风景区、庭院、楼台均有种植,形成了一个非常有区域特色传统川山茶栽培类群,并于1986年被正式命名为重庆市市花,多年来已发展成为重庆市文化内涵的重要组成部分。 

重庆南山植物园是我国乃至世界茶花种质资源库的重要基地,收集有山茶属相关种质600余份(包括种及各类栽培品种,如山茶类、滇茶类、油茶类、金花茶类等),并于2012年被国际茶花协会命名为“国际杰出茶花园”。川山茶是南山植物园山茶属资源种质中的一个重要的特色栽培类群,其花姿丰盈、端庄高雅,品种多样,花期长,花色鲜艳,瓣型丰富,尤其对重庆地区有着良好的生态适应能力,抗污染,易栽培,优良性状表现突出,具有较高的观赏及推广价值。 

ISSR (Inter simple sequence repeat,内部简单序列重复区间扩增) 和SSR(Simple sequence repeats,简单序列重复)是近年来广泛使用于各类植研究的分子标记技术,两者均无需预知物种基因组序列,具有实验操作简单、稳定性好、多态性丰富等优点,在进行植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建、基因连锁标记的寻找与基因定位和比较基因组学研究等方面得到了很好的应用[2-4]。本研究在预试验基础上,选择了对该PCR扩增体系稳定性影响较大的Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度5个因子进行体系优化试验,并在不同川山茶品种资源中进行初步应用与比较,以期建立起适合于川山茶品种的稳定的ISSR-PCR和SSR-PCR反应体系,为今后开展山茶的资源鉴定、品种选育以及系统进化与遗传多样性方面的研究奠定良好的试验基础。 

1/材料与方法 

1.1  材料 

供试川山茶品种材料均采自重庆南山植物园,于2015年8月采集当年生新叶,提取高质量DNA,用于相关扩增体系优化的研究。 

1.2  试剂及仪器 

试验中dNTP mixture、10×PCR buffer、Mg2+、Taq聚合酶和DNA marker等试剂均购自Takara公司;引物由上海生工生物工程公司合成。试验使用主要仪器有:C1000PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司),BIO-RAD凝胶成像系统,Mikko22R台式高速冷冻离心机; DYY-6C电泳仪;JY-JX5垂直电泳槽;DK-S26电热恒温水浴锅;754PC型紫外分光光度计(上海菁华公司生产)。 

1.3  方法 

1.3.1 基因组DNA的提取  

采用改良的CTAB法[5]提取山茶基因组DNA,1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量,将提取的DNA浓度稀释至40ng·L-1.保存在4℃冰箱待用,未稀释的DNA原液-20℃保存。 

1.3.2  正交试验设计方案  

选用L16(45)正交表(见表1、表2)。用川山茶品种茶睡莲DNA为模板,以ISSR引物UBC853和SSR引物A55进行试验,总体积均为20µl,加入2µl 10×Buffer,不足用超纯水补足,重复2次。 

1.3.3  PCR反应条件及电泳、成像   

ISSR-PCR扩增程序为:94℃ 5min,94℃ 1min,55℃1 min,72℃1min,35次循环,72℃ 最后延伸10min,扩增完后4℃保存。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,Gelred染色,在BIO-RAD凝胶成像系统成像。SSR-PCR扩增程序为94℃ 5min,94℃ 30s,52℃ 30s,72℃ 30s,38次循环,72℃ 最后延伸5min,扩增完后4℃保存。 

1.3.4  退火温度的确定  

根据正交试验,选择最佳反应体系对退火温度进行梯度试验,使用梯度PCR仪,ISSR-PCR设定45℃ ~57℃的退火温度梯度范围,自动生成8个温度:45℃、45.8℃、47.4℃、49.7℃、 52.6℃、55℃、56.3℃和57℃,进行ISSR-PCR退火温度的扩增比较,每个梯度设定6个重复;SSR-PCR设定50℃~60℃的退火温度梯度范围,自动生成8个温度:50℃、50.7℃、52℃、53.9℃、56.3℃、58.3℃、59.4℃和60℃,进行SSR-PCR退火温度的扩增比较,每个梯度设定2个重复。除退火温度外,反应程序与正交试验设计相同。 

1.3.5  最佳体系与程序验证   

用建立的ISSR-PCR及SSR-PCR最佳反应体系和程序对27份川山茶品种分别进行扩增稳定性验证。 

2/结果与分析 

2.1 PCR正交结果分析 

2.1.1 PCR正交试验直观分析 

根据表1和表2设计的16个处理进行PCR反应后,每组两个重复,电泳结果如图1、图2所示。根据电泳结果,将16个处理从高到低依次打分,评定指标为条带数量、清晰度、背景,最佳产物记为16分,最差记为1分。2次重复分别独立统计,ISSR-PCR正交试验16个组合的分数依次为2,1;1,1;4,1;4,2;1,1;1,1;11,11;10,10;1,1;5,1;13,13;11,11;5,5;9,9;6,8;8,8。SSR-PCR正交试验16个组合的分数依次为7,6;6,7;8,8;9,10;7,7;7,7;14,14;13,13;6,6;10,10;12,12;12,12;7,6;9,9;9,8;9,10。根据打分结果进行正交试验方差分析结果见表3、表4,可以看出,各因素水平的变化对山茶ISSR-PCR反应的影响从小到大依次为:Mg2+〉TaqDNA聚合酶〉dNTP〉引物〉模板DNA;各因素水平的变化对SSR-PCR反应的影响从小到大依次为:Mg2+〉TaqDNA聚合酶= dNTP〉模板DNA〉引物。 

各因素水平下的数据平均值ki反应了影响因素各水平对反应体系的影响情况,ki值越大,表明反应水平越好[6]。由表3、表4可知,反应中的5个影响因素的最佳反应水平组合并没有在正交表中出现,但ISSR-PCR反应中的5个影响因素的最佳反应水平组合与分值最高的11号组合接近,仅TaqDNA聚合酶和dNTP的用量不同;SSR-PCR反应中的5个影响因素的最佳反应水平组合与分值最高的7号组合接近,仅Mg2+和引物的用量不同。 

2.1.2 正交设计方差分析 

用SPSS软件对实验结果进行方差分析(表5~6)和多重比较分析(图3~4)。由表5、表6可知,ISSR-PCR方差分析中,除模板DNA和引物,其余因素(Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP)各水平对试验结果的影响均达到极显著水平(P≤0.01),SSR-PCR方差分析中,全部设置因素各水平对试验结果的影响均达到极显著水平(P≤0.01),可进一步进行因素内多重比较分析。 

ISSR-PCR多重比较分析表明,在20µL反应体系中,Taq酶量在0.75U与1U、1U与1.25U水平间的差异不显著,0.5U与0.75U水平间的差异达到显著水平。由图1可知,Taq酶量为1U时(9~12号处理)要比0.75U(5~8号处理)和1.25U(13~16号处理)时产生的条带略稳定、清晰,故确定1U为Taq酶最佳水平。Mg2+浓度在1 mmol·L-1和1.5 mmol·L-1、2 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1水平间差异不显著,但在1.5 mmol·L-1和2 mmol·L-1水平间的差异显著,结合图1,确定最佳Mg2+浓度为2 mmol·L-1。同样的分析得出本试验dNTP最佳浓度确定为0.15 mmol·L-1。 

同理,SSR-PCR多重比较分析表明,在20µL反应体系中,0.5U为最佳水平。Mg2+最佳浓度为2.5 mmol·L-1,DNA最佳浓度为50ng·µL-1,dNTPs最佳浓度为0.05mmol·L-1,引物最佳浓度为0.2µmol·L-1。结果显示,SSR-PCR反应所需Taq酶量、dNTPs和引物所需量均少于ISSR-PCR反应,表明川山茶分子标记试验中,SSR-PCR反应比ISSR-PCR反应具有更高的灵敏性。 

2.2退火温度对ISSR-PCR和SSR-PCR的影响 

根据正交试验结果,ISSR-PCR体系选择11号处理组合,SSR-PCR体系选择7号组合,进行退火温度梯度试验。由图5、图6可知,8个梯度的退火温度均能扩增出条带。反应温度太低或太高时,条带较模糊。在ISSR-PCR反应中45℃、45.8℃、47.4℃、56.3℃和57℃条带较模糊,49.7℃、52.6℃和55℃条带较清晰,但是49.7℃和52.6℃背景色较深,综合考虑,ISSR-PCR最佳退火温度为55℃。SSR-PCR反应中,50℃、50.7℃、58.3℃、59.4℃、60℃号带较模糊,52℃、53.9℃、56.3℃号带较明显,但是53.9℃、56.3℃号带背景色稍深。所以综上所述,SSR-PCR最佳退温度为52℃。 

2.3 川山茶ISSR-PCR及SSR-PCR最佳反应体系的验证 

分别用27个川山茶品种的DNA对优化获得的最佳的ISSR-PCR及SSR-PCR反应体系及扩增程序进行验证,结果见图7和图8。结果显示扩增产物条带清晰可见,主带明显,多态性高,表明已建立的反应体系及扩增程序稳定性较好。 

3 /讨论 

ISSR分子标记和SSR分子标记是基于PCR基础上的分子标记,反应中涉及到的各因子对不同物种扩增结果的特异性、稳定性及重复性有较大影响,因此对扩增体系进行优化是十分必要的[7]。其中,PCR反应是ISSR和SSR检测过程中一个重要的环节,建立稳定的PCR反应体系和扩增程序是ISSR和SSR分析的必要前提。该试验通过正交设计L16(45)对影响PCR扩增结果的Mg2+,dNTPs,引物,TaqDNA聚合酶和模板DNA浓度的影响等因素进行了探讨。相较于单因素试验设计的处理组合多,试验工作量大等不足,正交设计则分散均衡、整齐可比,效应明确,能够较快地找到最优的水平组合,节省了大量的时间以及人力物力。 

本试验结果表明,ISSR-PCR扩增体系除模板DNA和引物浓度外,其余因素对扩增效果的影响均达到极显著水平,其影响程度从大到小依次为Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP、引物、模板DNA;SSR-PCR扩增体系全部因子均对扩增效果的影响均达到极显著水平,其影响程度从大到小依次为Mg2+、TaqDNA聚合酶、 dNTP、模板DNA、引物。从此结果也说明,川山茶SSR-PCR比ISSR-PCR扩增体系具有更高的实验灵敏度和影响条件的复杂性。 

在PCR扩增反应中,dNTP浓度过低和过高均会影响到扩增条带的完整性和清晰度,浓度过低会降低扩增产物的得率及扩增条带较少,浓度过高会造成碱基的错误渗入而出现非特异性条带,还会导致引物二聚体的形成[8-9]。 

Mg2+浓度的高低会对PCR扩增产率和特异性造成较大影响[6],在所有因素中,Mg2+对扩增反应的结果影响最大,与卢莉[10]研究的结果相似,模板DNA、dNTP、引物中的磷酸基团均可与Mg2+结合而降低反应体系中游离Mg2的浓度,Taq聚合酶对Mg2+变化有着高灵敏反应,同时Mg2+浓度还影响着引物的退火温度、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性和引物二聚体的形成。 

引物的浓度是影响PCR扩增体系稳定性的另一重要因素,当引物浓度偏低时会使扩增条带数目减少或不清晰,过高时会促使引物错误引导非特异性产物的合成以及引物二聚体的形成,它们的形成将会与靶序列竞争Taq聚合酶及dNTP从而导致靶序列扩增量的降低及扩增条带的错误[11]。 

将本研究建立的扩增体系应用于不同山茶品种的大批量扩增时,均能扩增出较为清晰的高质量条带,但前提是要尽可能保证不同样品间DNA的纯度、完整性和浓度的相对一致性,以减少扩增结果误差。此外,后续研究表明,本试验建立的优化体系也可适用于华东山茶、云南山茶、金花茶及杂交山茶的相关分子标记研究中。 

参考文献: 

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:四十九卷第三册[M]. 北京: 科学技术出版社, 1998:4-5. 

[2]Angel Fernándezi Martí, Carolina Fonti Forcada, Rafel Socias i Company, et al. Genetic relationships and population structure of local olive tree accessions from Northeastern Spain revealed by SSR markers[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2015, 37 (1): 1-12. 

[3]Duane Fernandes Lima, Anna Victoria S. Mauad, Viviane Silva-Pereira, et al. Species boundaries inferred from ISSR markers in the Myrcia laruotteana complex (Myrtaceae)[J]. Plant Systematics and Evolution, 2015, 301 (1): 353-363. 

[4]Mamta Gupta, Bhawna Verma, Naresh Kumar, et al. Construction of intersubspecific molecular genetic map of lentil based on ISSR, RAPD and SSR markers[J]. Journal of Genetics, 2012, 91(3): 279-287. 

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[7]王廷华, 景强, Pierre Dubus. PCR理论与技术[M]. 北京: 科学出版社, 2006: 13-21. 

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[9]谈探, 金则新, 李钧敏, 等. 山茶ISSR扩增条件的优化[J]. 福建林业科技, 2007, 34(2): 24-27. 

[10]卢莉, 张强, 王玉花, 等. 利用正交设计优化茶树ISSR反应体系[J]. 经济林研究, 2010, 28(1): 14-19. 

[11]邹喻苹, 葛颂, 王晓东. 系统与进化植物学中的分子标记[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 36-90.