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8种杂草提取物抑制香樟炭疽病原菌活性初探

作者: 胡冲,田立超,吴道军 时间:2021-11-3 阅读次数:657

香樟(Cinnamomum camphora (Linn) Presl)生长速度快、枝叶茂密且冠形美观,具有避臭驱虫、吸毒气隔噪音等优点,作为城市园林植物被广泛种植[1-2]。近年来,多种香樟病虫害高发,以香樟炭疽病发生最为严重,根据2018-2020年重庆市园林植物体检工作报告,香樟炭疽病发生株率高达60%。该病其可致植物叶斑、叶枯,严重时导致香樟大量落叶甚至植株死亡[3]。根据作者前期研究成果,香樟炭疽病是由炭疽菌属Colletotrichum真菌引起的一类病害,作为一类重要的植物病原真菌,在热带和亚热带地区等区域均分布广泛[4]。目前我市园林管养一线开展香樟炭疽病防控多以化学药剂为主,尚无绿色药剂防控香樟炭疽病的研究报道[5]。

园林杂草多具有抗逆性强、养分需求低等特点,在园林绿地中普遍存在[6-8],且鲜有病虫发生,已有研究证实与杂草体内含有抑菌驱虫成分有关[9-10]。从自然界植物性材料中挖掘具有杀虫杀菌活性的物质成为了近年来绿色药剂开发的热点,该领域研究多聚焦于药用类草本植物[11-12]或植物精油的提取开发试验[13-14],针对杂草开展相关研究的报道较少。 

本文在室内条件下利用丙酮对藤三七等8种重庆地区园林杂草叶片进行成分粗提取,采用生长速率法研究其对香樟炭疽病病菌的生物抑菌活性,筛选具有抑制作用的植物粗提物,为植物源抑菌剂的开发提供理论基础。

1/材料和方法

1.1供试材料

1.1.1供试植物样品

科名 种名 采集信息
落葵科 藤三七Anredera cordifolia 采集地:重庆市高新区?采集时间:202009
菊科 加拿大一枝黄花Solidago canadensis 采集地:重庆市高新区、璧山区?采集时间:202010
桑科 葎草Humulus scandens 采集地:重庆市高新区?采集时间:202010
葡萄科 乌蔹莓Cayratia japonica 集地:重庆市高新区?采集时间:202006
菊科 白花鬼针草Bidens alba 采集地:重庆市高新区?采集时间:202010
旋花科 葛藤Argyreia seguinii 采集地:重庆市高新区?采集时间:202010
茄科 龙葵Solanum nigrum 采集地:重庆市高新区?采集时间:202010
木贼科 问荆Equisetum arvense 采集地:重庆市高新区、北碚?采集时间:202010

表1 供试园林植物粗提物来源

1.1.2供试真菌及来源

供试病原菌盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)为重庆市风景园林科学研究院保藏菌种。

1.2 试验方法

1.2.1 杂草丙酮提取物的制备

采集的植物样品洗净后切碎,阴干1-2d,置45℃恒温干燥箱中烘干,粉碎,过40目(孔径0.37mm)筛。称取50g粉碎好的杂草样品于500ml的无菌烧瓶中,加入200ml丙酮(分析纯,科龙化工),震荡提取3次,提取时间依次为1、2、3d,合并三次提取滤液,用旋转蒸发仪(上海亚荣)38℃真空浓缩获得浸膏状植物丙酮粗提物,得到提取物浸膏,根据公式计算出提取[15],浸膏用50%丙酮和5%吐温-80混合液溶解,稀释至浓度为0.5 g/mL的母液,置于4 ℃冰箱保存备用[16]。

提取率=(提取物质量/植物提取物粉末质量)X100%

1.2.2 抑菌活性测定方法

采用生长速率法测定供试植物丙酮提取物的抑菌活性[17]。根据作者前期浓度梯度预实验结果,分别取1.2.1所制备的药用植物丙酮提取物母液4.0 mL和2.0 mL用丙酮分别稀释为10倍和20倍,即得包括母液在内的3个浓度,即分别为1.0g/mL、0.1g/mL和0.05g/mL的植物样品浓度。用1.0mL的移液器分别取1.0mL上述3个植物提取物处理梯度浓度(对照取1.0mL丙酮)于已灭菌的20mL刻度试管中,加入10.0mL PDA,因丙酮容易挥发,所以最后培养基实际含植物粗提物的浓度分别为0.1g/mL、0.01g/mL和0.005g/mL,摇匀,倒入已灭菌的90mm培养皿中冷却待用。对照和处理都重复3次。挑取香樟炭疽病菌丝于PDA培养基上,25℃下预培养5d后,在靠近菌落边缘用直径为6mm的打孔器打取生长一致的供试病原真菌菌饼,用接种针挑至以上所制备的PDA平板中央,每个处理放置1个菌饼。接种时菌饼带菌丝的一面向下,并用接种针轻轻压紧,倒置于28℃、相对湿度为80%的人工气候箱中培养。待对照组菌落长满平皿后,用十字交叉法测量菌落直径,用下列公式计算菌丝生长抑制率[18]。

菌落直径(mm)=对照菌落直径(mm)-6 mm(菌饼直径)

抑制率(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/菌落直径]x100%

2/结果与分析

2.1 8种园林杂草叶片丙酮粗提物的提取

真空浓缩得到浸膏状后,放置45℃烘箱中得到固体后称重计算出提取率(见表2)。根据结果表明,提取率从大到小排列分别为:加拿大一枝黄花>问荆>藤三七>龙葵>白花鬼针草>葛藤>乌蔹莓>葎草。加拿大一枝黄花、问荆和藤三七的提取率最高,分别是8.59%、6.20%和5.02%。

供试植物 植物样品质量(g) 提取后产物质量(g) 提取率
藤三七 Anredera cordifolia 50 2.5121 5.02%
加拿大一枝黄花Solidago canadensis 50 4.2983 8.59%
葎草 Humulus scandens 50 1.2950 2.59%
乌蔹莓 Cayratia japonica 50 1.4313 2.86%
白花鬼针草 Bidens alba 50 1.8490 3.70%
葛藤 Argyreia seguinii 50 1.7252 3.45%
龙葵 Solanum nigrum 50 2.1022 4.20%
问荆 Equisetum arvense 50 3.0975 6.20%

2.2 8种园林杂草对病菌菌丝的抑菌作用

通过测量菌落直径取平均值,8种园林杂草对香樟炭疽病菌菌丝的抑制率结果见表3。由结果可知,三种浓度下,8种园林杂草对香樟炭疽病菌丝均有抑制作用,其中,龙葵、藤三七和加拿大一枝黄花抑制能力较为突出,在0.01g/ml浓度下,三种园林杂草抑制率分别为83.54%、81.57%和69.26%;0.002g/ml浓度下,其抑制率分别是75.20%、75.61%和65.31%;在0.001g/ml浓度下,其抑制率分别是65.54%、72.12%和62.13%,由此可见龙葵、藤三七和加拿大一枝黄花提取物的抑菌率均在60%以上。8种供试植物提取物中,葎草的抑制率最低,分别为24.19%、17.73%和17.63%。

供试植物 0.01g/ml 0.002g/ml 0.001g/ml
菌落直径(mm) 抑菌率(%) 菌落直径(mm) 抑菌率(%) 菌落直径(mm) 抑菌率(%)
藤三七Anredera cordifolia 21.48 81.57 26.49 75.61 29.42 72.12
加拿大一枝黄花Solidago canadensis 31.82 69.26 35.14 65.31 37.81 62.13
葎草Humulus scandens 69.68 24.19 75.11 17.73 75.19 17.63
乌蔹莓Cayratia japonica 43.72 55.09 51.54 45.79 57.96 38.14
白花鬼针草Bidens alba 36.56 63.62 65.31 29.39 77.27 15.15
葛藤Argyreia seguinii 36.46 63.74 60.47 35.15 78.15 14.11
龙葵Solanum nigrum 19.83 83.54 26.83 75.20 34.95 65.54
问荆Equisetum arvense 41.37 57.89 50.34 47.21 73.19 20.01
对照(CK) 90 / 90 / 90 /

8种丙酮提取物对香樟炭疽病的毒力回归方程和EC50值见表4。对香樟炭疽病病原菌的室内毒力结果显示,EC50从小到大排列分别为:藤三七0.0121g/L<加拿大一枝黄花0.0196 g/L<龙葵0.1528g/L<乌蔹莓4.5643 g/L<问荆4.9016 g/L<葛藤5.0640 g/L<百花鬼针草5.4153 g/L<葎草7933.27 g/L。由此可见,在相同质量浓度条件下,藤三七、加拿大一枝黄花和龙葵三种丙酮提取物的抑菌毒力较强。

供试植物 毒力回归方程 EC50 相关系数
藤三七Anredera cordifolia Y=0.3093X+5.5923 0.0121 0.9988
加拿大一枝黄花?Solidago canadensis Y=0.1877X+5.3205 0.0196 0.9883
葎草Humulus scandens Y=0.2458X+4.0415 7933.27 0.9602
乌蔹莓Cayratia japonica Y=0.4129X+4.7277 4.5643 0.9847
白花鬼针草Bidens alba Y=1.3599X+4.0023 5.4153 0.9983
葛藤Argyreia seguinii Y=1.3602X+4.0417 5.0640 0.9779
龙葵Solanum nigrum Y=0.5487X+5.4475 0.1528 0.9776
问荆Equisetum arvense Y=0.9249X+4.3615 4.9016 0.8787

3/结论与讨论

与化学农药防治植物病害相比,开发和利用植物源农药对城市环境更安全,在城市园林植物保护方面具有潜在应用前景[19]。杂草由于具有较强的抗病抗虫能力,有效挖掘其杀虫杀菌活性成分对园林植物病虫害绿色防控具有重要意义。本文利用重庆地区园林8种常见杂草叶片粗提物开展了香樟炭疽病病原菌的室内毒力测定。结果表明,从提取率来看,加拿大一枝黄花提取率最高,为8.59%,其次是问荆和藤三七,分别是6.20%和5.02%;从抑菌率和EC50结果反映出,藤三七、加拿大一枝黄花和龙葵三种园林杂草抑菌效果较为突出,而葎草的抑菌效果相对较差。

研究表明,藤三七中含有大量皂苷类和黄酮类化合物,除了降血糖[20]、抗氧化[21]等药理活性外,在抗菌消炎[22]等方面也发挥重要作用。本研究发现藤三七对香樟炭疽病的毒力回归方程为Y=0.3093X+5.5923,EC50值为0.0121,三种浓度下抑菌率均高于70%,表明藤三七对香樟炭疽病的抑制效果较高。加拿大一枝黄花(Solidago canadensis)曾作为观赏植物引入我国,但由于该植物繁殖力极强,缺乏本土天敌,导致目前在我国多地蔓延,成为严重破坏当地生态平衡的入侵性杂草[23]。有报道称加拿大一枝黄花精油在抑菌方面具有一定效果[24],因此可作为良好的候选杀菌剂。在本研究中,加拿大一枝黄花叶片丙酮提取物对香樟炭疽病菌的毒力回归方程为Y=0.1877X+5.3205,EC50值为0.0196,三种浓度下抑菌率均高于60%,抑制效果较高。龙葵为茄科植物,富含生物碱、皂苷、单宁和氨基酸等多种抑菌成分 [25],对番茄早疫、黄瓜枯萎、黄瓜黑星、辣椒丝核和小麦全蚀等10余种病原菌菌丝均有较高的抑制作用[25]。本研究中,龙葵对香樟炭疽病的毒力回归方程为Y=0.5487X+5.4475,EC50值为0.1528,三种浓度下抑菌率均高于65%,说明对该病原菌也有较强的抑制作用。

本试验中8种参试植物的抑菌试验结果对植物源抑菌活性成分研究具有一定参考价值,根据本试验提取率和抑菌率两方面结果可知,藤三七、加拿大一枝黄花和龙葵三种园林杂草对香樟炭疽病病原菌抑制作用较高,具体的活性成分分析有待进一步研究,后续试验可着重开展对加拿大一枝黄花、龙葵和藤三七的活性成分鉴定,以及进一步探究其抑菌活性和抑菌机理研究。

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