喇叭杜鹃组培快繁技术的研究

喇叭杜鹃（RhododendrondiscolorFranch.）常绿灌木或小乔木，属杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron），生于海拔900-1900米的林下或密林中。该物种花型美丽，颜色鲜艳，具有很高的观赏价值。但是，由于它生长于海拔较高的地方，且生长环境特殊，同时受季节和母本材料等的限制，导致目前无法进行大量的商品化生产。

杜鹃花的繁殖方式多样，常见的有种子繁殖、扦插繁殖、压条繁殖以及嫁接繁殖等[1]。不过，在杜鹃花科植物里，多数种类在扦插繁殖时生根困难，即便成功生根，受多种因素制约，也往往难以存活[2]。此外，播种、扦插和嫁接等繁殖方法易受季节和母株材料的限制，这使得杜鹃的繁殖系数下降，生长周期延长，不适合大规模的商业化生产[3]。

植物组织培养技术在繁育观赏植物方面优势显著，它具有繁殖系数高、繁殖速度快、不受季节影响且易于产业化等特点[4]。由于组织培养属于无性繁殖，后代发生变异的概率较低。而且与常规的扦插、嫁接、种子繁殖等方法相比，其繁殖速度大幅提升，繁殖率也相当高[5]。

目前，国内针对杜鹃花的研究主要聚焦于种子繁殖、扦插繁殖、压条繁殖、嫁接繁殖以及植物分类学等领域，而关于其组培快繁体系构建的研究报道相对较少[6]。在杜鹃资源的组织培养研究中，仅针对少数种类开展过相关工作[7,8]，关于喇叭杜鹃组织培养的研究更是鲜见。基于此，本试验致力于构建喇叭杜鹃的组织培养体系，期望能为其商品化生产提供基础支撑。

本试验以峨眉山野生喇叭杜鹃种子为材料，对喇叭杜鹃种子外植体消毒、诱导分化、增殖培养、生根培养进行系统研究，建立喇叭杜鹃的快繁技术体系，为进一步开展喇叭野生杜鹃的种质资源保存、新品种选育和繁育推广工作提供参考依据。

1／材料与方法 

1.1试验材料  

试验材料为喇叭杜鹃（Rhododendrondiscolor）的成熟种子，均采自海拔1000m以上的峨眉山风景区，并常温储存。试验前将成熟果荚剥开，取出种子，去除杂质；选取颗粒饱满、无虫害、病害的种子备用。

1.2试验方法

1.2.1种子最佳灭菌时长的筛选

用纱布包裹种子，并置于流水下冲洗10min，随后移入超净台进行灭菌。先用75%酒精漂洗30s，无菌水清洗3遍；再用2%次氯酸钠分别消毒1、2、3、4、5min，消毒后用无菌水冲洗5遍。将消毒后的种子放在滤纸上吸干水分后种接种于不添加激素的1/2MS培养基（蔗糖30g/L，琼脂8g/L,pH值调至5.8-6.0）。每个处理4瓶，每瓶10粒种子，每个处理重复3次。接种30d后统计污染率和发芽率，观察萌发情况。

1.2.2启动培养

启动培养是植物组织培养快速繁殖过程的基础，其目的是得到无菌材料，并使外植体发育。将培养基1/2MS上所得的喇叭杜鹃无菌材料，接种于含有不同浓度ZT和NAA的1/2MS培养基中进行初代培养。每瓶接种3个茎段，每个处理6瓶，每个处理重复3次，培养50d后统计结果。（表1）

1.2.3继代增殖培养

将初代培养获得的丛生芽切割成约1cm长、含单个芽的节段，接种至含有不同浓度TDZ和IBA的1/2MS培养基中。每瓶接3个芽，每个处理组6瓶，重复3次，培养50d观测结果。（表2）

1.2.4壮苗培养

将不定芽增殖产生的继代苗进行壮苗培养，接种至含有不同浓度的NAA和IBA的1/2MS培养基中进行培养，每瓶接种3株，每个处理10瓶，重复3次，50d后观察生长状况。（表3）

1.2.5生根培养 

将在壮苗培养基上长度达到3cm，叶片4叶以上、叶色深绿、健壮的芽进行生根培养。接种至添加不同激素浓度的IBA和IAA的WPM培养基中进行培养,每个处理组6瓶,每瓶接苗3株,设3次重复,60d后观察并统计生根情况。(表4)

2／结果与分析

2.1 消毒时长对种子灭菌的影响

由表5可以看出，利用2%次氯酸钠对喇叭杜鹃进行灭菌时，增加灭菌时间可以显著降低种子的污染率，但随着消毒时间的增加，发芽率呈先下降后上升的趋势。综合考虑，喇叭杜鹃最合适消毒时间是2%次氯酸钠灭菌2min。

2.2启动培养

由表6极差分析可以看出，不同浓度的IBA与ZT的组合对喇叭小苗的启动率有一定影响，9种处理下的启动率存在明显差异，最优的激素组合为ZT2.0mg.L-1+IBA0.1mg.L-1。

2.3继代增殖培养

表7、8极差分析可见:TDZ对喇叭杜鹃的增殖效果较好,在供试浓度范围内,随着TDZ浓度的升高,增殖倍数也提高,但幼苗发育一般，综合考虑最适宜喇叭杜鹃增殖的激素组合为TDZ0.3mg.L-1+IBA1.0mg.L-1。

2.4壮苗培养

由表9通过极差分析和试管苗长势可以看出，当NAA和IBA浓度均为1mg·L-1时，试管苗的平均株高最高，且长势最好。最适宜喇叭杜鹃壮苗的激素组合为NAA1.0mg·L-1+IBA1.0mg·L-1。

2.5生根培养 

 以WPM为基本培养基，培养基中分别添加不同浓度的IBA和IAA,经过40d培养后统计生根率。根据极差大小，IBA对高山杜鹃生根率的影响最显著，其次是IAA，AC的影响相对最小。结果表明（表10）：16个处理中12号处理的生根率最高，为96.7%；在这16个处理中可以发现，含有IBA的处理中，生根率普遍高于含有IAA的。含有IAA的8个处理中，生根率最高仅达到43.32%。而含IBA的8个处理中，生根率最高达96.7%。这说明在生根培养中，IBA比1AA能更好的促进植株生根。综上所述，最适宜喇叭杜鹃生根的培养基为WPM+IBA2mg·L-1+AC1.0mg·L-1。

3／讨论

3.1消毒方式对外植体的影响

 在无菌播种，常用的消毒剂有升汞、次氯酸钠、乙醇等，一般采取多种灭菌联合使用可以提高灭菌效果［9］，升汞的消毒效果最好，但其对植物材料的伤害较大。次氯酸钠可以水解形成次氯酸，通过细菌的细胞壁，其强氧化性破坏菌体和病毒上的蛋白质等酶系统，从而杀死微生物，不易残留，对环境无害［10］。因此，本试验采用75%酒精和2%次氯酸钠联合处理对喇叭杜鹃种子进行灭菌。结果表明，采用此种方式进行灭菌，种子污染率最低，萌芽率最高。对喇叭杜鹃的最佳灭菌时间为2min。

3.2植物生长调节剂对喇叭杜鹃组织培养的影响

3.2.1植物生长调节剂对启动培养的影响

在开展启动培养工作时，本研究挑选ZT作为细胞分裂素。钟宇［11］等人在其研究里指出，ZT具备较强的诱导分化能力。陈幼妹［12］在相关研究中运用了改良后的1/4MS培养基，经过实验得出，在此培养基条件下相对更为优良的激素组合是1/4MS+ZT2mg·L-1+IAA0.5mg·L-1。何芳兰［13］在组培研究中同样采用了ZT与IBA的组合方式，最终确定最佳启动组合为ZT1mg·L-1＋IBA0.05mg·L-1。此外，黄萍萍［14］在研究过程中发现，当ZT浓度处于1-3mg·L-1范围时，诱导率和诱导系数会随着浓度的升高而上升，由此得出，高山杜鹃（蒙他瑰）在1/4MS培养基上相对理想的激素组合为ZT2mg·L-1＋IAA0.5mg·L-1。然而，本试验所得到的最佳启动培养组合是1/2MS＋ZT2mg·L-1＋IBA0.1mg·L-1。

3.2.2植物生长调节剂对继代增殖的影响

在进行杜鹃培养时，通常会选用KT、6－BA、ZT等植物激素，而在国外，2－ip、TDZ的应用更为普遍。范玉清［15］的研究指出，TDZ活性较高，是培养那些较难培养的植物，特别是木本植物时较为适宜的细胞分裂素。基于此，本研究选择了噻苯隆（TDZ）作为细胞分裂素。

目前，关于杜鹃组织培养已有相关研究。苗永美［16］采用TDZ和IBA组合对大树杜鹃、桃叶杜鹃的愈伤组织进行增殖培养，结果显示增殖率均达到了100％。苗永美［16］最终确定的增殖培养最佳激素组合为TDZ0.4mg·L-1＋IBA0.05mg·L-1。而本试验所得到的最佳增殖配方为1/2MS＋TDZ0.3mg·L-1＋IBA1.0mg·L-1。

3.2.3植物生长调节剂对瓶苗生根的影响

在木本植物中,杜鹃生长是比较缓慢的,其组培周期较长,组培苗的生根诱导也一直是个难题。喇叭杜鹃组培试验结果分析表明,基本培养基的生根诱导效果为WPM+IBA2.0mg·L-1+AC1.0mg·L-1,生根效果最好。添加AC后,生根效果显著,随着浓度的增加,生根率增大,这与吴雅文等迷人杜鹃的组培研究结果一致。

英文缩写注释:

MS：MurashigeandSkoogMedium，MS培养基，是植物组织培养中常用的一种基础培养基，含有较高浓度的氮、磷、钾等营养元素，能满足多数植物组织生长和分化的需求。

ZT：Zeatin，玉米素，一种天然的细胞分裂素，能促进植物细胞分裂、分化，诱导芽的形成和生长，在植物组织培养的启动培养和增殖培养中常被使用。

IBA：Indole-3-ButyricAcid，吲哚-3-丁酸，一种常用的生长素类植物生长调节剂，主要作用是促进植物生根，也能促进细胞伸长和分裂，在植物组织培养的生根培养及壮苗培养中应用广泛。

TDZ：Thidiazuron，噻苯隆，一种人工合成的细胞分裂素类植物生长调节剂，活性较高，能有效诱导植物组织分化、促进芽的增殖，尤其在一些难培养植物（如木本植物）的组织培养中效果显著。

NAA：1-NaphthaleneaceticAcid，α-萘乙酸，一种广谱性生长素类植物生长调节剂，可促进植物细胞伸长和分裂，诱导生根，也能用于防止器官脱落、促进果实发育等，在植物组织培养的壮苗培养和生根培养中较为常用。

WPM：WoodyPlantMedium，木本植物培养基，专为木本植物组织培养设计的一种培养基，其氮、磷浓度相对较低，更符合木本植物组织生长的营养需求，在木本植物（如杜鹃）的生根培养中应用较多。

IAA：Indole-3-AceticAcid，吲哚-3-乙酸，是植物体内天然存在的一种生长素，能促进植物细胞伸长、分裂和分化，参与植物生长发育的多个过程，如根的形成、茎的伸长等，在植物组织培养中也可用于诱导生根。

AC：ActivatedCarbon，活性炭，在植物组织培养中，活性炭具有吸附培养基中有害物质（如酚类物质）、调节培养基pH值、提高培养基透气性等作用，同时也能促进植物生根，改善组培苗的生长状况。

参考文献：

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